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氫氣知識

氫水降低百草枯誘導的大鼠急性肺損傷

發布時間:2017-07-17 瀏覽次數:次 字號:  【關閉】
發表雜志:Journal of Biomedicine and Biotechnology
通訊單位:第二軍醫大學
疾病種類:急性肺損傷
實驗對象:SD大鼠
給氫方式:富氫水,口服
給氫劑量:濃度0.4 mM,任意攝取
給氫時間:72 h
觀察組織:肺
作用效果:氫水可以抑制百草枯誘導的肺組織MDA水平升高,緩解急性肺損傷。

氫耗水減少百草枯所致大鼠急性肺損傷
摘要
百草枯暴露導致急性肺損傷,氧化應激被廣泛認為是導致百草枯急性肺損傷的一個因素。最近的研究報告說,飲用水中溶解的分子氫達到飽和水平(氫水)可以防止氧化應激引起的疾病。本文研究了飽和氫鹽對大鼠百草枯急性肺損傷的保護作用。成年雄性Sprague Dawley(SD)大鼠隨機分為四組:對照組、氫水唯一組(HW組)、百草枯組(PQ組)、百草枯和氫水組(PQ + HW組)。對照組和硬件組大鼠飲用純凈水或氫水;PQ組和PQ HW組大鼠腹腔注射百草枯(35 毫克/公斤),然后提供純凈水或氫水。測量肺組織生化和組織學改變。結果表明,氫水改善了這些變化,說明氫水可能通過抑制氧化損傷減輕百草枯誘導的急性肺損傷。
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1。介紹
Paraquat(1,1-dimethyl-4,4-bipyridilium酰氯,PQ)是一種廣泛使用的接觸式和非選擇性除草劑的季氮。它于1962首次在農業中引入,造成了數千人死亡,無論是偶然或自愿攝入。百草枯的毒性是以氧化還原循環誘導氧化應激引起的細胞死亡和炎癥為基礎的。由于肺內選擇性積聚,導致嚴重的肺損傷,表現為水腫、出血、間質炎癥和進行性纖維化[ 1, 2 ]。許多研究表明百草枯損傷的機制主要與氧化應激有關[ 3 - 5 ]。百草枯誘導的氧化還原循環可產生超氧陰離子、NO和其他自由基,導致氧化損傷[ 2, 6, 7 ]。所有這些自由基、羥自由基和氧化劑過氧亞硝酸鹽可能是最毒的,因為他們的反應與生物大分子如DNA、蛋白質和脂質,,導致DNA斷裂、脂質過氧化和蛋白質失活。羥基自由基產生的超氧陰離子和過氧化氫,分別通過Haber-Weiss反應和芬頓反應[ 8, 9 ],而過氧亞硝基陰離子可能沒有的快速反應與超氧陰離子[ 10, 11 ]誘導。
氫,無色、無味,無臭,無刺激性,且極易燃燒的雙原子氣體,通常被視為在高壓氧醫學生理惰性氣體。1975和2001,Dole等人。和Gharib等人,分別報道,高壓下氫可能是一個治療癌癥和寄生蟲的氣體通過消除有毒活性氧[ 12, 13 ]引起的肝臟炎癥。2007、Ohsawa et al.。發現2%具有抗氧化和抗凋亡活性氫吸入通過選擇性地減少羥自由基和過氧亞硝基陰離子[ 14 ]。氫的重要性立即引起了廣泛關注。各種不同的方法來管理諸如氫、氫氣吸入,口服氫水、腹腔、靜脈注射氫氣飽和生理鹽水,已被證明對許多ROS誘導的疾病是有效的,包括肝缺血缺氧性心肌損傷、新生兒缺氧缺血性損傷,人類II型糖尿病、順鉑和帕金森病[ 15–20 ]腎毒性。特別是,各種型號的肺損傷也可以用氫氣來防止[ 21 - 23 ]。考慮到氧化應激,尤其是羥自由基和過氧亞硝基陰離子,對百草枯誘導的肺損傷,我們研究了氫的作用口服百草枯誘導的炎癥反應,氧化應激,與肺相關的損傷,通過組織學和生化指標評估。

2。材料與方法
2.1。動物
四十的成年雄性Sprague Dawley大鼠體重250±10 G被用于這項研究。所有實驗程序都是按照ROC第二軍醫大學機構動物護理和使用委員會批準的動物護理和使用指導原則進行的。
2.2。氫水的制備
對于飽和氫水制備、純化后的氫氣溶解于純凈水兩小時0.6 MPa下。在無體積的鋁袋中,在4℃常壓下儲存飽和氫水。每周制備氫氣水,保持連續濃縮。用氫電極確認了氫氣含量。每一天,從鋁袋水氫被放置在一個封閉的玻璃容器,以保證氫濃度大于0.4后,有一天 毫米。氫水輕輕攪拌脫氣用于百草枯組;氫氣完全去除與氫電極證實,相似,Ohsawa et al.。[ 24 ]。
2.3。實驗協議
Paraquat是從sigma(圣路易斯,穆村,美國)獲得的。大鼠隨機分為四組:對照組(n=10),氫水唯一組(HW組,N=10);百草枯組(PQ組,N=10);百草枯和氫水組(HW + PQ組,n=10)。對照組和HW組灌服純凈水或氫水。PQ組和PQ HW組大鼠腹腔注射百草枯(35 毫克/公斤),然后使用純凈水或氫水自由采食72 h,分別。為確保氫氣濃度大于0.4 毫米,新鮮的水是每12 h后口服氫水管理已由永田等人測量H2在血液中的濃度,約為5 μM [ 25 ]。在72 小時,動物放血以腹主動脈和隨后的程序
2.4。胸腔積液及Lung Wet/干重比的測定
腹主動脈放血后,胸腔積液收集插入18號針頭通過膜片10毫升注射器和退出胸腔內所有流體。然后整塊切除肺,切除心臟和胸腺。右肺中葉立即稱重,然后放入烘箱在60°C 96 H 穩定干重。用濕/干重比量化肺含水量。
2.5。BALF采集
BALF進行左肺4 毫升磷酸鹽平衡鹽溶液在2.5毫升等分左氣管插管后。收集BALF離心1000 G 10分鐘;上清液并存儲在−20 C和80 C°−°后蛋白測定和LDH活性。
2.6。支氣管肺泡灌洗液中細胞總數、總蛋白和乳酸脫氫酶活性
在新的流體試樣用血球計數儀測定總細胞計數。經BCA蛋白濃度測定試劑以牛血清白蛋白為標準測定BALF中總蛋白含量(Pierce,羅克福德,IL,美國)。LDH活性、細胞氧化損傷的一個指標,測定在490 nm 根據制造商的指示使用乳酸脫氫酶測定試劑盒(羅氏分子生化、曼海姆、德國)。LDH活性以乳酸脫氫酶標準表達。
2.7。Lung Malondialdehyde(MDA)測量
根據操作手冊使用MDA測定試劑盒測定肺組織MDA含量(碧云天,Haimen,中國)。簡言之,冷凍肺組織勻漿。離心后,上清液中游離MDA轉換為用n-methyl-2-phenylindole化學反應穩定carbocyanin染料。采用BCA法測定蛋白濃度(皮爾斯,羅克福德、IL、美國)以牛血清白蛋白為標準。MDA水平正常化對蛋白質(pmol /毫克)。
2.8。免疫組織化學和TUNEL染色
動物放血后的腹主動脈,右肺下葉切除后轉移到4%甲醛48 H.肺進行石蠟包埋,和5mm厚度的蝶形切片,放在顯微鏡玻片蘇木精-伊紅染色(HE)的病理分析。Apoptosis檢測DNA鏈斷裂用末端脫氧核苷酸轉移酶介導的生物素標記的UTP缺口末端標記(TUNEL)根據制造商的程序(bipec生物制藥、馬薩諸塞州、馬)。在10個隨機選擇的高功率場中計算凋亡細胞的平均百分比。數據以TUNEL陽性細胞與總細胞的比率表示。值為平均值掃描電鏡(n=10)。
2.9。統計分析
所有值均為平均值。單因素方差分析由學生Newman Keuls試驗確定組間差異。p<01的水平被認為具有統計學意義。

三.結果
3.1。氫水對胸腔積液的影響
百草枯注射液72小時后,PQ和PQ + HW組大鼠均有胸腔積液。然而,在PQ組積液的體積明顯更大(8 毫升)比PQ HW組(2.8 毫升,P<01)(圖1)。
圖1
圖1
對 氫水對胸腔積液的影響。PQ組大鼠表現出在72小時結束 在胸腔積液的體積增大,而在PQ HW組增加明顯減小(* P 01相比…
3.2。氫水對肺水腫的影響
PQ組大鼠的濕/干重比對照組高8.5(4.8,p<01)。PQ + HW組肺濕/干重比也增加(5.6),但明顯低于PQ組(圖2)(p<01)。
圖2
圖2
對 氫水對肺水腫的影響。PQ組大鼠肺濕/干重比明顯高于對照組(p<01)。與PQ組相比,PQ + HW組大鼠的濕/干重比顯著降低…
3.3。飽和氫鹽對支氣管肺泡灌洗液中LDH、總細胞和蛋白含量的影響
暴露于百草枯的大鼠與對照組大鼠相比,BAL液LDH水平顯著升高(p<01)。然而,增加了PQ明顯較大(70.38 U/mL)比PQ HW組(30.13 U/ml,P<0。01)。與對照組相比,百草枯組BALF中的細胞總數和蛋白含量均增加(p<01),但PQ顯著高于PQ組(p<01)(表1)。
表1
飽和氫鹽對BALF乳酸脫氫酶、總細胞和蛋白濃度的影響。暴露于百草枯的大鼠與對照組大鼠相比,BAL液LDH水平顯著升高,而顯著低于對照組…
3.4。肺組織丙二醛
肺組織MDA水平升高在PQ組(34.9 μmol/g)和PQ +硬件組(20.7 μmol/g)在控制和HW組比較(10.9 μmol/g,9.1 μmol/g,P<0。01)。然而,PQ的增加比PQ + HW組要大得多(圖3
肺組織丙二醛。我們的研究結果表明,百草枯增加肺丙二醛水平。相反,在PQ HW組MDA含量均較小(* P<01與控制;?P<0。01相比,PQ組)。
3.5。組織病理學檢查
三組大鼠肺切片組織病理學分析結果如圖4所示。兩組實驗組肺組織學差異有顯著性。單獨注射百草枯大鼠肺出血、水腫、肺泡間隔增厚、炎性細胞浸潤和纖維蛋白沉積。與此相反,在PQ + HW組,發現類似的變化,但在較小程度上,提示減輕肺損傷。
組織病理學檢查。兩組實驗組肺組織學差異有顯著性。明顯的肺出血、水腫、肺泡間隔增厚、炎性細胞浸潤和纖維蛋白沉積…
3.6。飽和氫鹽對細胞凋亡的影響
PQ組大鼠肺組織凋亡指數(14.3%)明顯高于對照組(2.2%,p<01)。PQ + HW組大鼠凋亡指數亦升高(6.9%),但明顯高于PQ組(圖5)。
飽和氫鹽對細胞凋亡的影響。PQ組大鼠肺組織凋亡指數與對照組比較有顯著性差異。相反,PQ + HW組大鼠表現出明顯的下降…

4。討論
百草枯中毒的治療迄今為止還沒有有效的治療方法,主要是試圖減少其吸收或提高其清除率[ 26 ]。由于氧化損傷被稱為百草枯毒性的關鍵問題,研究了幾種抗氧化劑來改善百草枯所致的肺損傷。提示糖皮質激素和環磷酰胺可能對百草枯中毒有效(27, 28)。然而,有效性還沒有得到其他人的同意[ 29 ]。對其他抗氧化劑對氧化性肺損傷的保護作用也進行了研究,但結果令人失望。GSH在氧化劑引起的肺損傷的保護中是無效的,因為它很快從肺中清除[ 30 - 32 ]。超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的影響是有限的,因為他們無法跨越生物膜[ 26, 30, 33 - 36 ]。其他一些抗氧化劑,如αα-生育酚,提供有限的保護,因為他們的極端性[ 37 ]。因此,尋求一種合適和有效的治療百草枯誘導的肺損傷的方法仍在繼續
本研究旨在探討氫對百草枯所致肺損傷的保護作用。由于氫氣是爆炸性的,它的臨床應用可能是危險的;我們選擇口服氫水進行治療,其有效性已經得到了證實[ 24, 25, 38,39 ]。生物化學檢測結果和我們研究的組織病理學結果表明氫耗水降低了百草枯誘導的肺損傷和氧化應激的嚴重程度。
PQ + HW組大鼠肺損傷程度明顯較低,表現為胸腔積液體積小、氣道內蛋白質積累量少、細胞總數減少,與PQ組相比,形態學改變較少。PQ + HW組Lung W/d比值顯著低于PQ組,顯示肺水腫改善。BALF的LDH水平和肺組織中的丙二醛(細胞脂質過氧化和氧化損傷的可靠指標(15, 22))所知道的,在氫處理的大鼠中較少,表明氫可以減輕氧化損傷。氧化損傷的預防是百草枯染毒大鼠肺保護作用的可能機制。
已有研究表明肺細胞凋亡是百草枯致肺損傷的重要事件[ 40 ]。氫的抗凋亡作用是新生兒缺血缺氧大鼠模型[ 17 ]所示。為了檢測過氧化氫是否對百草枯誘導的大鼠肺損傷具有同樣的凋亡抑制作用,采用TUNEL染色法檢測肺細胞凋亡情況。我們發現細胞凋亡有明顯的抑制作用,與先前的研究結果一致。
與傳統抗氧化劑相比,新開發的抗氧化劑氫有許多優點。首先,由于其分子量小,可以輕易穿透生物膜的氫擴散進入細胞質,線粒體和細胞核[ 15 ]。其次,因為氫和羥基自由基和過氧亞硝基陰離子選擇性反應,其他重要的ROS(如H2O2和O2−)參與細胞的信號并沒有降低,所以代謝的氧化-還原反應不被打擾。第三,氫的組織相容性比許多其他抗氧化劑都大。在肺中,H2的應用具有獨特的優點。一方面,潛水多年來,氫氣被用作吸入氣體,并已證明對肺是安全的[ 15 ]。另一方面,由于肺血流量大,肺是H2的代謝器官,口服或注射富含氫氣的液體后,它很容易到達肺部。氫的所有這些特性使氫水的消耗是一個有希望的治療百草枯中毒肺損傷的方法。

5。結論
總之,我們的研究證實氫水可以減少百草枯引起的肺損傷。在這些令人鼓舞的結果之后,還應進行進一步的研究,以澄清這些保護作用,并闡明這種保護的確切機制。
去:
利益沖突
作者聲明沒有利益沖突。
去:
致謝
這項研究是由中國國家自然科學基金項目(30971199)。作者感謝康志明博士和李潤平博士在他們的實驗室,嚴格論文的修改。
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